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上海易色醫療科技有限公司提供四款體外培養細胞支原體污染用《快速支原體檢測試劑盒和支原體檢測方法》，分別是：《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》。還介紹了細胞支原體污染的圖片、表現、危害、癥狀、來源、途徑、怎么辦和如何處理的方法。

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四 款 細 胞 支 原 體 污 染 用 快 速 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 ? ? 上 海 易 色 醫 療 科 技 有 限 公 司 S h a n g h a i Y i s e M e d i c a l T e c h n o l o g y C o . , L t d . 上 海 易 色 — — 支 原 體 檢 測 專 家 ！ 首 頁 公 司 簡 介 上 市 產 品 產 品 價 格 下 載 中 心 聯 系 我 們 本 公 司 招 牌 產 品 【 四 款 細 胞 培 養 用 快 速 《 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 （ 點 擊 進 入 ） 】 之 一 細 胞 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 詳 細 介 紹 ? ? 一 、 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 主 要 用 途 ? ? 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 ? 測 試 劑 盒 》 主 要 用 于 檢 測 細 胞 培 養 上 清 或 別 的 液 體 樣 品 中 是 否 含 有 支 原 體 污 染 ， 該 試 劑 盒 僅 用 于 基 礎 科 研 。 ? 二 、 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 擴 增 原 理 ? ? 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 采 用 獨 特 的 恒 溫 基 因 擴 增 技 術 和 顯 色 技 術 ， 對 樣 品 的 支 原 體 基 因 組 D N A 進 行 恒 溫 擴 增 ， 反 應 完 后 ， 通 過 反 應 管 的 顏 色 即 可 對 結 果 進 行 判 斷 。 ? ? ? ? 三 、 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 八 大 優 點 ? ? 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 八 大 優 點 ? ? （ 1 ） ? 極 端 方 便 ， 整 個 檢 測 過 程 只 需 一 步 即 可 完 成 。 （ 2 ） ? 極 端 省 時 ， 整 個 檢 測 過 程 只 需 1 小 時 ， 而 P C R 法 通 常 需 要 2 3 小 時 。 （ 3 ） 靈 敏 度 良 好 ， 一 般 比 3 0 個 循 環 普 通 P C R 靈 敏 度 高 。 （ 4 ） 無 需 樣 品 的 前 處 理 。 由 于 細 胞 培 養 數 天 后 ， 培 養 液 中 經 常 含 有 嚴 重 抑 制 P C R 擴 增 的 代 謝 物 ， 所 以 樣 品 的 前 處 理 一 般 是 P C R 法 不 可 或 缺 的 環 節 。 而 R D R C A 擴 增 不 受 抑 制 ， 無 需 樣 品 的 前 處 理 。 （ 5 ） 無 需 樣 品 的 離 心 濃 縮 ， 檢 測 只 需 1 微 升 培 養 液 即 可 。 （ 6 ） 無 需 用 到 P C R 儀 、 電 泳 槽 、 凝 膠 成 像 儀 、 離 心 機 等 儀 器 ， 整 個 檢 測 只 需 一 個 水 浴 鍋 即 可 完 成 。 （ 7 ） 無 需 電 泳 ， 無 需 接 觸 E B 等 誘 癌 物 質 。 根 據 反 應 管 的 指 示 劑 ， 肉 眼 即 可 判 斷 反 應 結 果 。 （ 8 ） 產 品 穩 定 性 極 好 ， 凍 干 型 產 品 可 以 在 室 溫 至 少 放 置 2 個 月 ， 2 0 ℃ 至 少 可 以 放 置 2 年 。 ? 四 、 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 法 與 P C R 法 的 靈 敏 度 和 抗 干 擾 性 比 較 ? ? ? ? 將 有 支 原 體 污 染 的 細 胞 培 養 液 上 清 用 水 做 系 列 稀 釋 （ R D R C A 做 1 0 倍 系 列 稀 釋 、 P C R 做 5 倍 系 列 稀 釋 ） ， 而 后 分 別 用 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 和 普 通 P C R 進 行 支 原 體 檢 測 。 ? ? ? ? 如 右 圖 所 示 ， 采 用 R D R C A 法 的 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 在 稀 釋 1 0 0 0 0 倍 后 仍 呈 明 顯 的 陽 性 而 普 通 P C R ( 3 0 c y c l e s ) 在 稀 釋 1 2 5 倍 后 呈 勉 強 的 弱 陽 性 ， 二 者 靈 敏 度 至 少 相 差 8 0 倍 。 ? ? 另 外 一 個 值 得 高 度 注 意 的 是 ： 用 細 胞 培 養 上 清 原 液 進 行 P C R 檢 測 居 然 呈 明 顯 的 陰 性 ！ 而 原 液 用 水 稀 釋 5 倍 后 ， P C R 卻 呈 陽 性 。 說 明 ： 細 胞 培 養 上 清 原 液 含 有 強 烈 抑 制 P C R 的 代 謝 物 ！ ? ? 與 此 形 成 鮮 明 對 比 的 是 ： 采 用 R D R C A 法 的 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 卻 能 在 細 胞 培 養 上 清 原 液 中 檢 測 出 支 原 體 污 染 ！ 說 明 ： 同 樣 的 代 謝 產 物 雖 然 強 烈 抑 制 P C R 卻 不 會 抑 制 R D R C A 的 正 常 擴 增 。 ? ? 這 是 R D R C A 法 的 巨 大 優 勢 ！ 如 此 ， R D R C A 就 不 需 要 進 行 樣 品 的 稀 釋 或 者 進 行 支 原 體 D N A 的 抽 提 等 的 前 處 理 。 ? 特 別 提 醒 ： ? ? ? ? ? 該 實 驗 也 說 明 ： 如 果 使 用 的 P C R 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 沒 有 內 參 對 照 ， 而 直 接 使 用 細 胞 培 ? ? 養 上 清 原 液 進 行 P C R 檢 測 ， 檢 測 結 果 即 使 為 陰 性 ， 也 不 能 說 明 其 沒 有 支 原 體 污 染 ， 極 有 可 能 是 P C R 的 擴 增 被 細 胞 的 代 謝 產 物 抑 制 了 ！ 這 個 問 題 絕 大 部 分 進 行 支 原 體 檢 測 的 人 員 都 不 會 注 意 ， 這 是 利 用 無 內 參 對 照 的 P C R 法 進 行 支 原 體 檢 測 的 致 命 弱 點 ! 【 注 ： 由 于 本 公 司 現 在 生 產 的 《 P C R 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 （ 貨 號 ： P M 0 0 8 ） ， 含 內 參 對 照 ， 已 經 可 以 區 分 真 陰 性 樣 品 （ 樣 品 無 支 原 體 污 染 。 電 泳 結 果 ： 有 內 參 條 帶 ， 無 支 原 體 特 異 條 帶 ） 和 假 陰 性 樣 品 （ P C R 被 代 謝 產 物 抑 制 。 電 泳 結 果 ： 內 參 條 帶 和 支 原 體 特 異 條 帶 都 沒 有 ） 。 詳 情 請 參 考 本 公 司 生 產 的 《 P C R 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 說 明 書 】 ? ? ? ? 有 關 P C R 的 擴 增 會 被 細 胞 的 代 謝 產 物 抑 制 的 問 題 ， S i g m a 公 司 的 L o o k O u t M y c o p l a s m a P C R D e t e c t i o n K i t （ 貨 號 M P 0 0 3 5 1 k i t ） 的 P C R 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 說 明 書 中 也 特 別 提 到 了 這 點 ， 其 強 烈 建 議 用 試 劑 盒 進 行 D N A 提 取 后 再 進 行 檢 測 。 可 見 這 是 利 用 P C R 法 進 行 支 原 體 檢 測 過 程 中 普 遍 遇 到 的 問 題 ， 應 該 引 起 科 研 工 作 者 的 高 度 重 視 ！ 否 則 ， 由 此 引 起 的 假 陰 性 （ 培 養 時 間 越 久 ， 概 率 越 高 ） ， 將 使 無 內 參 對 照 的 P C R 法 進 行 的 支 原 體 檢 測 變 得 毫 無 意 義 ！ ? ? 五 、 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 產 品 形 式 ? ? 本 公 司 所 有 恒 溫 基 因 檢 測 產 品 主 要 以 凍 干 品 的 形 式 提 供 （ 如 右 圖 所 示 ） 。 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 同 樣 以 凍 干 品 的 形 式 提 供 。 采 用 凍 干 技 術 ， 將 所 有 擴 增 成 分 都 凍 干 在 一 個 0 . 2 m L 的 P C R 管 中 ， 使 用 時 只 需 加 入 水 化 液 和 待 測 樣 品 ， 整 個 檢 測 過 程 一 步 即 可 完 成 ， 非 常 簡 單 。 此 外 ， 由 于 凍 干 品 的 穩 定 性 非 常 好 ， 可 以 在 室 溫 保 存 至 少 2 個 月 ， 這 樣 非 常 方 便 運 輸 和 儲 存 ， 也 非 常 適 合 在 野 外 或 者 污 染 點 進 行 即 時 檢 測 。 該 工 藝 的 創 新 極 大 的 擴 展 了 相 關 產 品 的 市 場 應 用 前 景 。 ? ? 六 、 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 說 明 書 ? ? ? ? 產 品 重 要 信 息 （ 1 ） 產 品 價 格 ： 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 （ 貨 號 ： M D 0 0 1 ） ； 價 格 ： 8 0 0 元 / 5 0 次 （ 平 均 每 個 樣 品 1 6 元 ） 。 （ 2 ） 產 品 說 明 書 ： ? P D F 版 說 明 書 ， 請 到 本 公 司 網 站 “ 下 載 中 心 ” 頁 面 下 載 ！ （ 凍 干 型 產 品 暫 停 供 應 ） 。 （ 3 ） 方 法 學 報 告 ： 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 方 法 學 報 告 ， 請 到 本 公 司 網 站 “ 下 載 中 心 ” 頁 面 下 載 ！ 細 胞 培 養 專 用 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 （ 溶 液 型 ） 使 用 說 明 書 （ 版 本 2 0 2 4 0 2 0 6 b ） 【 本 說 明 書 會 不 定 期 更 新 ， 每 次 收 到 新 的 產 品 時 ， 請 到 本 公 司 網 站 重 新 下 載 最 新 版 本 ！ 】 貨 號 ? ? ? ? M D 0 0 1 包 裝 規 格 ? ? ? ? 5 0 次 / 盒 儲 存 條 件 ? ? ? ? 該 產 品 隨 冰 袋 運 輸 ， 收 到 產 品 后 請 立 即 放 2 0 ℃ 冰 箱 保 存 ， 該 條 件 下 ， 至 少 3 年 內 仍 然 有 活 性 。 產 品 用 途 ? ? ? ? 《 一 步 恒 溫 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 （ O n e s t e p Q u i c k c o l o r M y c o p l a s m a D e t e c t i o n K i t ） 主 要 用 于 檢 測 細 胞 培 養 液 或 別 的 液 體 樣 品 中 是 否 含 有 支 原 體 。 本 產 品 僅 供 科 研 使 用 。 產 品 簡 介 ? ? ? ? 哺 乳 動 物 細 胞 的 培 養 ， 支 原 體 （ M y c o p l a s m a ） 污 染 是 個 世 界 性 的 問 題 。 支 原 體 污 染 幾 乎 可 以 改 變 細 胞 的 所 有 參 數 ， 導 致 實 驗 結 果 的 不 準 確 、 甚 至 完 全 錯 誤 （ 支 原 體 污 染 對 細 胞 的 詳 細 危 害 ， 請 參 考 本 公 司 的 網 站 ： w w w . y i s e m e d . c o m ） 。 從 2 0 1 3 年 開 始 ， 《 N a t u r e 》 期 刊 已 正 式 要 求 投 稿 的 文 章 ， 如 涉 及 細 胞 培 養 都 要 進 行 支 原 體 檢 測 。 相 信 會 有 越 來 越 多 的 高 水 平 期 刊 將 做 出 同 樣 的 支 原 體 檢 測 要 求 。 ? ? ? ? 培 養 法 是 相 對 可 靠 的 支 原 體 檢 測 技 術 ， 但 是 該 方 法 非 常 耗 時 的 ， 需 要 數 周 ， 不 適 合 作 為 細 胞 培 養 液 中 支 原 體 污 染 的 快 速 檢 測 。 此 外 ， 通 過 固 體 培 養 法 無 法 檢 測 污 染 細 胞 的 一 種 最 常 見 的 支 原 體 ， 即 豬 鼻 支 原 體 （ M . H y o r h i n i s ） 。 這 是 因 為 豬 鼻 支 原 體 無 法 在 支 原 體 固 體 培 養 基 上 形 成 可 見 的 菌 落 。 而 豬 鼻 支 原 體 約 占 所 有 支 原 體 污 染 的 2 0 5 0 % 。 ? ? ? ? 有 的 實 驗 室 使 用 熒 光 染 色 法 檢 測 支 原 體 ， 但 是 該 方 法 靈 敏 度 太 低 ， 而 且 嚴 重 依 賴 實 驗 人 員 的 經 驗 ， 實 驗 的 穩 定 性 極 差 。 此 外 ， 當 該 方 法 檢 測 成 陽 性 時 ， 細 胞 經 常 已 經 嚴 重 污 染 。 ? ? ? ? 培 養 法 和 熒 光 染 色 法 雖 然 是 我 國 藥 典 收 錄 的 支 原 體 檢 測 方 法 ， 但 是 因 為 其 各 自 都 有 明 顯 的 缺 點 ， 不 適 合 作 為 支 原 體 快 速 檢 測 的 方 法 。 ? ? ? ? 本 公 司 目 前 已 經 開 發 出 四 種 不 同 原 理 的 快 速 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 ， 分 別 是 ： 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 、 《 P C R 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 、 《 發 光 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 和 《 探 針 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 ， 其 各 自 都 有 自 己 的 優 缺 點 （ 詳 情 請 參 考 本 公 司 網 站 ） 。 ? ? ? ? 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 使 用 獨 特 的 恒 溫 基 因 擴 增 技 術 ， 有 明 顯 的 優 點 ： （ 1 ） 整 個 檢 測 過 程 只 需 1 小 時 ， 大 大 縮 短 了 檢 測 時 間 ； （ 2 ） 未 發 現 細 胞 培 養 液 中 的 P C R 抑 制 劑 會 抑 制 恒 溫 基 因 擴 增 ， 所 以 一 般 無 需 進 行 樣 品 的 前 處 理 ； （ 3 ） 恒 溫 基 因 擴 增 的 靈 敏 度 良 好 ， 一 般 比 3 0 個 循 環 普 通 P C R 法 高 ； （ 4 ） 恒 溫 基 因 擴 增 的 產 物 無 需 電 泳 ， 可 以 通 過 指 示 劑 的 顏 色 變 化 直 接 肉 眼 判 斷 反 應 結 果 ； （ 5 ） 無 需 用 到 P C R 儀 、 電 泳 槽 、 凝 膠 成 像 儀 等 儀 器 ， 整 個 檢 測 過 程 只 需 一 個 水 浴 鍋 。 ? ? ? ? 《 一 步 恒 溫 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 主 要 缺 點 ： （ 1 ） 支 原 體 識 別 率 相 對 較 低 ， 大 約 只 能 識 別 污 染 細 胞 所 有 支 原 體 種 類 的 9 9 % 左 右 ， 還 有 大 約 1 % 的 支 原 體 可 能 無 法 識 別 ， 從 而 導 致 假 陰 性 ； （ 2 ） 高 濃 度 的 血 清 和 相 關 血 液 制 品 、 二 價 離 子 和 E D T A 等 可 能 會 對 顯 色 結 果 產 生 干 擾 （ 注 ： 可 以 通 過 離 心 清 洗 去 除 干 擾 ） ， 導 致 結 果 誤 判 。 ? ? ? ? 經 測 試 ， 本 試 劑 盒 至 少 可 以 檢 測 以 下 1 3 種 支 原 體 ： （ 1 ） M . h y o r h i n i s 、 （ 2 ） M . f e r m e n t a n s 、 （ 3 ） M . a r g i n i n i 、 （ 4 ） M . h o m i n i s 、 （ 5 ） M . o r a l e 、 （ 6 ） M . s a l i v a r i u m 、 （ 7 ） M . p i r u m 、 （ 8 ） A . l a i d l a w i i 、 （ 9 ） M . a g a l a c t i a e 、 （ 1 0 ） M . b o v i s 、 （ 1 1 ） M . b u c c a l e 、 （ 1 2 ） M . a r t h r i t i d i s 、 （ 1 3 ） M . p u l m o n i s （ 注 ： M . 為 M y c o p l a s m a 的 縮 寫 ； A . 為 A c h o l e p l a s m a 的 縮 寫 ） 。 其 中 ， 前 8 種 為 是 最 常 見 的 污 染 細 胞 的 支 原 體 種 類 ， 約 占 污 染 細 胞 的 支 原 體 的 9 8 % 左 右 。 以 上 1 3 種 約 占 污 染 細 胞 的 支 原 體 種 類 的 9 9 % 左 右 （ 注 ： 目 前 文 獻 報 道 ， 體 外 細 胞 支 原 體 污 染 的 種 類 大 概 有 1 9 2 0 種 ， 具 體 支 原 體 種 類 請 看 本 公 司 《 P C R 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 說 明 書 ） 。 注 意 ： 本 試 劑 盒 無 法 檢 測 U r e a p l a s m a U r e a l y t i c u m 支 原 體 （ 注 ： 該 支 原 體 污 染 細 胞 的 概 率 極 低 ） ！ ? ? ? ? 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 的 檢 測 靈 敏 度 ： 經 測 試 ， 在 每 個 反 應 管 的 D N A 加 入 量 為 2 μ L 的 情 況 下 ， 《 一 步 恒 溫 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 的 最 高 檢 測 靈 敏 度 （ 即 檢 測 下 限 ） 大 約 在 2 0 4 0 0 個 c o p i e s ， 即 1 0 2 0 0 c o p i e s / μ L 。 可 以 通 過 離 心 濃 縮 、 提 取 支 原 體 基 因 組 D N A 等 措 施 ， 其 檢 測 靈 敏 度 可 以 在 此 基 礎 上 繼 續 提 高 1 0 1 0 0 倍 。 ? ? ? ? 由 于 任 何 一 種 快 速 支 原 體 檢 測 方 法 都 無 法 保 證 檢 測 結 果 1 0 0 % 正 確 ， 如 果 您 想 得 到 1 0 0 % 正 確 的 支 原 體 檢 測 結 果 （ 比 如 ， 開 展 細 胞 治 療 的 客 戶 ， 進 行 干 細 胞 培 養 的 客 戶 ， 生 產 血 清 、 胰 酶 、 培 養 液 的 客 戶 ， 出 售 各 種 原 代 培 養 細 胞 系 和 腫 瘤 細 胞 系 的 客 戶 等 ） ， 任 選 本 公 司 生 產 的 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 、 《 P C R 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 、 《 發 光 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 和 《 探 針 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 中 的 兩 種 進 行 檢 測 ， 將 會 得 到 比 較 滿 意 的 結 果 。 如 果 幾 種 不 同 支 原 體 檢 測 方 法 的 檢 測 結 果 一 致 ， 正 確 率 幾 乎 就 是 1 0 0 % 。 試 劑 盒 組 成 （ 1 ） 溶 液 1 ： 1 1 5 0 μ L （ 5 0 次 檢 測 ） ； （ 2 ） 溶 液 2 ： 5 5 μ L ； （ 3 ） 溶 液 3 ： 指 示 劑 ， 3 8 μ L ； （ 4 ） 陽 性 支 原 體 D N A ： 5 0 μ L 。 ? 需 要 自 己 準 備 的 耗 材 和 試 劑 ： （ 1 ） 0 . 2 m L 透 明 度 良 好 的 平 蓋 P C R 管 ； （ 2 ） 2 0 0 μ L 和 1 0 μ L 濾 芯 吸 頭 （ 比 如 A x y g e n 公 司 ） 。 以 上 兩 種 耗 材 可 以 在 淘 寶 網 購 買 ； （ 3 ） 礦 物 油 ： 由 于 大 部 分 客 戶 都 使 用 P C R 儀 進 行 反 應 ， 無 需 使 用 礦 物 油 。 使 用 水 浴 鍋 進 行 反 應 的 客 戶 ， 請 自 己 購 買 礦 物 油 【 推 薦 ： 從 上 海 生 工 生 物 公 司 購 買 ， 貨 號 ： B 5 0 0 3 0 1 0 1 0 0 ， 每 瓶 1 0 0 m L 約 需 5 0 元 ， 每 個 試 劑 盒 大 約 需 要 1 . 5 m L ； 或 者 從 本 公 司 購 買 （ 1 . 5 m L / 支 ） ， 1 0 元 / 支 】 。 檢 測 過 程 1 . 待 測 樣 品 的 準 備 ： ? ? ? 為 了 準 確 判 斷 細 胞 是 否 有 支 原 體 的 污 染 ， 待 測 的 細 胞 培 養 液 樣 品 需 要 取 自 換 液 后 培 養 2 3 天 且 匯 合 度 在 9 0 % 左 右 的 細 胞 培 養 液 上 清 （ 貼 壁 細 胞 ） 。 懸 浮 培 養 的 細 胞 也 需 要 在 換 液 傳 代 后 ， 讓 細 胞 生 長 2 3 天 再 取 培 養 液 進 行 檢 測 。 可 以 按 照 以 下 兩 種 方 法 之 一 進 行 樣 品 的 前 處 理 ： 方 法 一 ： 直 接 檢 測 （ 該 方 法 無 法 去 除 可 能 的 干 擾 物 ， 顯 色 被 干 擾 的 可 能 性 相 對 較 大 ） ： （ 1 ） 取 1 5 0 μ L 上 述 待 測 樣 品 到 1 . 5 m L 離 心 管 內 ， 在 普 通 臺 式 離 心 機 上 1 0 0 0 r p m ( 大 約 1 5 0 g ) 低 速 離 心 5 m i n u t e s ， 取 離 心 后 的 上 清 1 0 0 μ L 用 于 支 原 體 檢 測 ， 丟 棄 下 層 剩 余 的 5 0 μ L （ 含 細 胞 沉 淀 ） 。 （ 2 ） 已 經 離 心 去 除 細 胞 的 待 測 樣 品 可 以 直 接 檢 測 ， 也 可 以 進 行 熱 處 理 后 再 檢 測 （ 熱 處 理 后 ， 樣 品 保 存 更 穩 定 ） ， 具 體 如 下 ： 9 5 ℃ 加 熱 處 理 5 m i n u t e s （ 可 以 轉 移 到 P C R 管 內 ， 在 P C R 儀 上 進 行 加 熱 處 理 ） ， 簡 單 離 心 （ 1 0 0 0 g ， 5 s e c o n d s ） 后 ， 取 上 清 進 行 檢 測 。 ? 方 法 二 ： 簡 單 離 心 清 洗 （ 推 薦 方 法 。 該 方 法 不 僅 可 以 濃 縮 支 原 體 從 而 提 高 檢 測 的 相 對 靈 敏 度 ， 還 可 以 去 除 絕 大 部 分 可 能 的 干 擾 物 ， 顯 色 被 干 擾 的 可 能 性 極 小 。 如 果 該 簡 單 一 步 離 心 清 洗 的 方 法 仍 然 無 法 去 除 干 擾 物 ， 可 以 使 用 后 文 注 意 事 項 部 分 的 三 步 離 心 清 洗 的 方 法 。 ） ： （ 1 ） 根 據 濃 縮 倍 數 ， 可 以 取 1 0 0 1 5 0 0 μ L 上 述 待 測 樣 品 到 1 . 5 m L 離 心 管 內 ， 在 普 通 臺 式 離 心 機 上 1 0 0 0 r p m ( 大 約 1 5 0 g ) 低 速 離 心 5 m i n u t e s ， 將 離 心 后 的 上 清 轉 移 到 另 一 個 離 心 管 內 ， 丟 棄 細 胞 沉 淀 。 （ 2 ） 將 上 清 繼 續 1 3 0 0 0 r p m （ 約 1 6 0 0 0 g ） 高 速 離 心 5 m i n u t e s ， 小 心 吸 走 全 部 上 清 （ 為 避 免 碰 到 底 部 沉 淀 ， 可 以 保 留 底 部 3 5 μ L 液 體 ） ， 用 2 0 5 0 μ L 5 m M T r i s H C l , p H 8 . 0 8 . 8 （ 樣 品 可 以 長 期 保 存 。 推 薦 ） 或 者 去 離 子 水 （ 樣 品 比 較 不 穩 定 ， 只 適 合 當 天 或 短 期 內 檢 測 使 用 ） 重 懸 沉 淀 （ 沉 淀 中 含 有 支 原 體 ） ， 吹 吸 均 勻 【 如 果 最 初 使 用 了 1 5 0 0 μ L 的 樣 品 而 最 后 用 2 0 μ L 重 懸 ， 則 支 原 體 濃 度 大 約 提 高 了 7 5 倍 ， 相 對 靈 敏 度 也 提 高 了 7 5 倍 】 。 （ 3 ） 該 重 懸 后 的 樣 品 可 以 直 接 檢 測 ， 也 可 以 進 行 熱 處 理 后 再 檢 測 （ 熱 處 理 后 ， 樣 品 保 存 更 穩 定 ） 。 熱 處 理 具 體 如 下 ： 9 5 ℃ 加 熱 處 理 5 m i n u t e s （ 可 以 轉 移 到 P C R 管 內 ， 在 P C R 儀 上 進 行 加 熱 處 理 ） ， 簡 單 離 心 （ 1 0 0 0 g ， 5 s e c o n d s ） 后 ， 取 上 清 進 行 檢 測 。 ? 注 1 ： 這 里 的 細 胞 培 養 上 清 不 是 指 細 胞 經 胰 酶 消 化 后 的 離 心 上 清 ， 而 是 指 至 少 培 養 2 天 后 的 貼 壁 細 胞 培 養 液 上 清 （ 不 需 要 胰 酶 消 化 ， 也 不 能 取 經 胰 酶 消 化 后 的 離 心 上 清 進 行 檢 測 ） 或 懸 浮 細 胞 培 養 液 。 ? 注 2 ： 本 步 驟 的 低 速 離 心 是 為 了 去 除 哺 乳 動 物 細 胞 ， 以 排 除 其 不 必 要 的 干 擾 。 所 以 離 心 力 要 嚴 格 控 制 在 1 5 0 2 0 0 g ， 該 離 心 力 下 ， 哺 乳 動 物 細 胞 將 被 沉 淀 下 來 而 支 原 體 不 會 。 如 果 錯 誤 使 用 更 高 的 離 心 力 將 可 能 導 致 支 原 體 也 被 離 心 下 來 ， 從 而 導 致 假 陰 性 。 ? 注 3 ： 收 集 的 待 測 細 胞 培 養 液 樣 品 如 果 不 立 即 檢 測 ， 請 放 于 2 0 ℃ 或 8 0 ℃ 冰 箱 保 存 ， 不 得 放 于 室 溫 或 4 ℃ 冰 箱 。 樣 品 在 2 0 ℃ 至 少 可 以 保 存 一 個 月 ， 在 8 0 ℃ 可 以 長 期 保 存 。 此 外 ， 為 了 節 約 檢 測 成 本 ， 可 以 將 不 同 時 間 收 集 的 樣 品 放 于 2 0 ℃ 或 8 0 ℃ 冰 箱 保 存 ， 而 后 一 起 檢 測 。 ? 注 4 ： 如 果 預 期 待 測 樣 品 支 原 體 含 量 較 少 （ 比 如 ， 低 溫 保 存 的 血 清 、 臍 帶 血 、 胰 酶 、 抗 生 素 、 未 使 用 的 培 養 液 、 生 物 制 品 、 極 個 別 細 胞 培 養 上 清 等 ） ， 可 以 采 取 措 施 以 提 高 檢 測 的 靈 敏 度 ， 具 體 方 法 請 看 后 文 注 意 事 項 部 分 ： 如 果 提 高 本 試 劑 盒 檢 測 靈 敏 度 。 2 . 反 應 體 系 的 配 制 【 本 步 驟 所 有 操 作 強 烈 建 議 使 用 進 口 濾 芯 吸 頭 （ 比 如 A x y g e n 濾 芯 吸 頭 ） 進 行 操 作 ， 以 避 免 試 劑 被 污 染 。 操 作 之 前 ， 請 認 真 看 完 后 文 的 注 意 事 項 后 ， 再 進 行 操 作 】 ： （ 1 ） 將 溶 液 1 和 溶 液 3 從 2 0 ℃ 冰 箱 中 取 出 ， 室 溫 融 化 后 ， 開 蓋 之 前 ， 甩 動 溶 液 1 的 離 心 管 將 管 壁 溶 液 甩 到 管 底 ， 而 溶 液 3 必 須 離 心 （ 大 約 3 0 0 0 r p m ， 離 心 1 分 鐘 ） 一 下 ， 吹 吸 均 勻 后 【 注 ： 溶 液 1 和 溶 液 3 每 次 融 化 后 都 必 須 吹 吸 均 勻 后 再 吸 取 ， 溶 液 2 和 溶 液 3 開 蓋 之 前 ， 請 離 心 一 下 】 ， 按 表 1 進 行 反 應 體 系 的 配 制 ： ? ? ? ? ? ? ? 具 體 配 置 體 系 ， 請 根 據 P D F 版 說 明 書 進 行 操 作 ！ （ 2 ） 將 上 述 配 制 好 的 恒 溫 反 應 體 系 ， 吹 打 均 勻 后 ， 按 每 管 2 4 μ L 分 裝 到 0 . 2 m L 的 P C R 管 中 。 ? ? 注 ： 1 ） 盡 量 保 證 每 管 的 反 應 液 體 積 一 樣 。 如 果 分 裝 時 最 后 一 管 反 應 液 不 足 ， 可 以 將 其 作 為 陰 性 對 照 管 ； 2 ） P C R 管 應 該 使 用 透 明 度 良 好 的 P C R 管 。 （ 3 ） 陰 性 對 照 管 （ N e g a t i v e ） 可 以 不 加 ， 也 可 以 加 入 1 μ L 滅 菌 水 （ 建 議 不 加 ） ； 往 測 試 管 （ T e s t ） 中 加 入 1 2 μ L 待 測 樣 品 （ 前 處 理 使 用 方 法 一 的 ， 建 議 加 1 μ L ； 前 處 理 使 用 方 法 二 的 ， 建 議 加 2 μ L ） ； 往 陽 性 對 照 管 （ P o s i t i v e ） 中 加 入 1 μ L 陽 性 支 原 體 D N A 。 反 應 液 的 總 體 積 為 2 5 μ L 。 ? 注 ： 1 ） 裝 有 陽 性 支 原 體 D N A 的 螺 口 管 請 不 要 高 速 離 心 ， 開 蓋 之 前 ， 只 要 用 手 指 捏 住 ， 用 力 甩 一 下 即 可 。 吸 取 之 前 ， 請 吹 吸 均 勻 后 再 吸 取 。 如 果 不 小 心 高 速 離 心 了 ， 務 必 吹 吸 均 勻 后 再 吸 取 ， 否 則 陽 性 對 照 結 果 可 能 異 常 。 2 ） 進 行 反 應 體 系 配 制 的 房 間 ， 與 樣 品 前 處 理 、 加 陽 性 對 照 D N A 、 樣 品 D N A 的 房 間 最 好 分 開 。 3 . 反 應 （ 選 擇 以 下 方 式 之 一 進 行 反 應 ） ： （ 1 ） 水 浴 內 反 應 （ 注 意 ： 本 產 品 只 能 使 用 含 水 的 普 通 水 浴 鍋 ， 不 能 在 沒 有 水 的 純 金 屬 浴 內 反 應 ， 因 為 沒 有 水 的 純 金 屬 浴 溫 度 非 常 不 準 確 。 ） ： 往 每 個 反 應 管 內 加 入 2 5 μ L 礦 物 油 ， 以 防 止 水 份 揮 發 ， 蓋 上 蓋 子 ， 將 反 應 管 插 入 帶 孔 的 漂 板 內 ， 放 入 已 經 升 溫 到 6 1 ℃ 的 普 通 水 浴 內 ， 準 確 反 應 6 0 分 鐘 。 ? 注 ： 在 反 應 之 前 ， 水 浴 鍋 必 須 先 升 溫 到 6 1 ℃ ， 再 放 入 反 應 管 。 此 外 ， 必 須 用 水 銀 溫 度 計 測 量 水 溫 ， 確 保 水 浴 鍋 的 溫 度 準 確 。 本 試 劑 盒 所 用 的 酶 對 溫 度 非 常 敏 感 ， 只 允 許 儀 器 顯 示 溫 度 與 實 際 溫 度 的 溫 差 不 超 過 1 ℃ 。 （ 2 ） P C R 儀 上 反 應 ： 有 P C R 儀 的 實 驗 室 ， 強 烈 建 議 在 P C R 儀 上 進 行 反 應 ， 這 樣 可 以 準 確 控 制 反 應 的 時 間 和 溫 度 。 P C R 儀 參 數 如 下 ： 6 1 ℃ ， 6 0 m i n ； 1 0 ℃ , f o r e v e r ； 熱 蓋 溫 度 ， 1 0 5 ℃ 。 ? 注 ： 在 帶 熱 蓋 的 P C R 儀 上 進 行 反 應 ， 無 需 在 反 應 管 內 加 入 礦 物 油 （ 現 在 的 P C R 儀 基 本 都 是 帶 熱 蓋 的 ） 。 4 . 結 果 判 斷 ： 6 1 ℃ 反 應 6 0 分 鐘 后 ， 立 刻 取 出 反 應 管 ， 放 于 室 溫 。 以 一 張 白 紙 或 白 色 泡 沫 盒 （ 優 選 白 色 泡 沫 ） 為 背 景 ， 通 過 反 應 管 溶 液 顏 色 的 變 化 ， 即 可 判 斷 檢 測 結 果 。 如 果 溶 液 為 藍 綠 色 ， 則 說 明 有 支 原 體 污 染 ； 如 果 為 紫 紅 色 ， 則 說 明 沒 有 支 原 體 污 染 （ 如 圖 1 ） 。 ? 注 1 ： 在 6 1 ℃ 反 應 的 時 間 必 須 準 確 計 時 ， 超 過 說 明 書 規 定 的 反 應 時 間 可 能 會 出 現 假 陽 性 （ 最 多 不 得 超 過 5 分 鐘 ） 。 如 果 試 劑 盒 已 經 過 期 或 者 發 生 其 他 意 外 情 況 影 響 酶 活 性 時 ， 萬 一 發 現 ： 6 1 ℃ 反 應 6 0 分 鐘 后 ， 陽 性 和 陰 性 顏 色 區 別 不 明 顯 ， 可 以 考 慮 將 已 經 反 應 6 0 分 鐘 的 反 應 管 ， 繼 續 在 6 1 ℃ 的 水 浴 或 P C R 儀 上 反 應 1 0 分 鐘 。 但 是 如 果 6 1 ℃ 反 應 6 0 分 鐘 后 ， 陽 性 與 陰 性 的 區 別 一 眼 就 可 以 看 出 ， 不 得 繼 續 反 應 ， 否 則 可 能 出 現 假 陽 性 。 以 上 只 是 意 外 情 況 下 的 補 救 措 施 。 ? 注 2 ： 如 果 反 應 后 ， 發 現 個 別 樣 品 的 顏 色 介 于 陽 性 和 陰 性 之 間 （ 正 常 這 種 情 況 應 該 概 率 很 低 ， 如 果 經 常 出 現 ， 樣 品 中 可 能 含 有 可 干 擾 正 常 指 示 效 果 的 物 質 ， 必 須 先 去 除 。 去 除 方 法 見 后 文 注 意 事 項 部 分 ） ， 可 以 將 這 些 樣 品 繼 續 6 1 ℃ 反 應 1 0 分 鐘 。 1 0 分 鐘 后 ， 如 果 其 顏 色 仍 然 與 陽 性 對 照 的 顏 色 不 同 ， 該 樣 品 應 該 判 為 陰 性 。 這 種 可 疑 樣 品 建 議 用 相 同 試 劑 盒 或 者 不 同 原 理 的 其 他 試 劑 盒 （ 如 本 公 司 的 《 P C R 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 、 《 發 光 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 和 《 探 針 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 ） 進 行 復 檢 。 ? 注 3 ： 反 應 后 ， 請 勿 打 開 反 應 管 的 蓋 子 ， 否 則 有 可 能 造 成 檢 測 環 境 的 污 染 。 結 果 判 斷 完 后 ， 將 其 用 自 封 袋 密 閉 ， 扔 到 另 外 一 個 房 間 的 垃 圾 桶 內 。 ? 注 4 ： 不 同 批 次 的 產 品 ， 以 及 由 于 拍 照 等 原 因 ， 反 應 后 陽 性 對 照 和 陰 性 對 照 的 顏 色 可 能 會 與 本 說 明 書 書 圖 1 的 顏 色 略 有 差 異 （ 比 如 陰 性 對 照 顏 色 可 能 呈 現 淺 紅 色 或 紫 紅 色 ） 。 只 要 反 應 后 陽 性 對 照 與 陰 性 對 照 的 顏 色 有 顯 著 區 別 ， 就 說 明 反 應 成 功 。 ? ? ? 圖 1 . 左 邊 為 陰 性 反 應 結 果 ， 右 邊 為 陽 性 反 應 結 果 。 注 意 事 項 1 . 請 確 保 樣 品 加 入 后 ， 反 應 之 前 ： 陰 性 、 陽 性 和 所 有 待 測 樣 品 的 顏 色 基 本 一 致 。 如 果 個 別 樣 品 ， 一 旦 加 入 ， 反 應 管 的 顏 色 就 與 陰 性 、 陽 性 明 顯 不 同 ， 說 明 其 中 含 有 可 干 擾 本 系 統 正 常 指 示 效 果 的 物 質 ， 必 須 先 去 除 。 此 現 象 曾 經 在 檢 測 C H O 無 血 清 培 養 基 和 一 些 血 液 制 品 （ 比 如 ： 白 蛋 白 溶 液 、 血 漿 原 液 、 血 清 原 液 等 ） 上 發 生 過 。 常 見 的 D M E M 、 M E M 、 F 1 2 、 1 6 4 0 等 培 養 基 （ 可 以 含 1 0 % 血 清 ） 一 般 不 會 發 生 該 現 象 。 去 除 方 法 ： （ 1 ） 離 心 清 洗 ： 取 1 m L 細 胞 上 清 或 待 測 樣 品 （ 比 如 ： 白 蛋 白 溶 液 、 血 漿 原 液 、 血 清 原 液 ） ， 先 1 3 0 0 0 r p m 離 心 5 m i n ， 吸 走 9 5 0 μ L 上 清 ； 加 P B S 9 5 0 μ L ， 再 次 離 心 ， 吸 走 9 5 0 μ L 上 清 ； 再 加 P B S 9 5 0 μ L ， 第 三 次 離 心 ， 小 心 吸 走 全 部 上 清 （ 為 避 免 碰 到 底 部 沉 淀 ， 可 以 保 留 底 部 3 5 μ L 液 體 ） ， 用 2 0 5 0 μ L 5 m M T r i s H C l , p H 8 . 0 8 . 8 （ 樣 品 可 以 長 期 保 存 。 推 薦 ） 或 者 去 離 子 水 （ 樣 品 比 較 不 穩 定 ， 只 適 合 當 天 或 短 期 內 檢 測 使 用 ） 重 懸 沉 淀 ， 吹 吸 均 勻 。 該 重 懸 后 的 樣 品 可 以 直 接 檢 測 ， 也 可 以 進 行 熱 處 理 后 再 檢 測 （ 熱 處 理 后 ， 樣 品 保 存 更 穩 定 ） 。 熱 處 理 具 體 如 下 ： 9 5 ℃ 加 熱 處 理 5 m i n u t e s （ 可 以 轉 移 到 P C R 管 內 ， 在 P C R 儀 上 進 行 加 熱 處 理 ） ， 簡 單 離 心 （ 1 0 0 0 g ， 5 s e c o n d s ） 后 ， 取 上 清 進 行 檢 測 。 由 于 離 心 清 洗 可 能 導 致 支 原 體 部 分 丟 失 ， 如 果 樣 品 支 原 體 含 量 很 低 ， 可 能 導 致 漏 檢 。 （ 2 ） 使 用 本 公 司 《 支 原 體 基 因 組 D N A 提 取 試 劑 盒 》 提 取 支 原 體 D N A 后 進 行 檢 測 。 通 過 D N A 提 取 ， 即 可 以 將 所 有 可 能 的 干 擾 物 質 全 部 去 除 ， 又 可 以 將 支 原 體 D N A 濃 縮 1 0 1 0 0 倍 。 2 . 由 于 恒 溫 擴 增 所 用 的 各 種 酶 強 烈 依 賴 溶 液 中 的 二 價 離 子 ， 待 測 樣 品 的 E D T A 等 金 屬 離 子 螯 合 劑 只 能 微 量 存 在 。 如 果 打 算 用 試 劑 盒 提 取 支 原 體 D N A （ 推 薦 使 用 本 公 司 《 支 原 體 基 因 組 D N A 提 取 試 劑 盒 》 ） ， 請 用 去 離 子 水 或 者 不 含 E D T A 的 5 m M T r i s . H C l （ p H 8 . 0 8 . 8 ） 的 緩 沖 液 洗 脫 和 溶 解 D N A 。 3 . 防 D N A 污 染 注 意 事 項 ： （ 1 ） 恒 溫 反 應 體 系 配 制 的 房 間 （ 本 試 劑 盒 請 在 有 窗 戶 、 通 風 良 好 的 普 通 房 間 操 作 。 請 勿 在 密 閉 的 細 胞 培 養 間 進 行 該 步 驟 的 操 作 ， 因 為 細 胞 培 養 間 支 原 體 污 染 概 率 很 高 ） ， 與 用 于 樣 品 前 處 理 、 加 陽 性 對 照 D N A 、 樣 品 D N A 的 房 間 一 定 要 分 開 。 （ 2 ） 強 烈 建 議 使 用 濾 芯 吸 頭 （ 比 如 A x y g e n 濾 芯 吸 頭 ） 吸 取 相 關 溶 液 和 陽 性 支 原 體 等 。 如 果 沒 有 濾 芯 吸 頭 ， 至 少 應 該 使 用 新 開 封 的 吸 頭 。 （ 3 ） 必 須 確 保 使 用 的 移 液 槍 本 身 沒 有 殘 留 的 支 原 體 。 因 此 ， 最 好 使 用 全 新 購 買 的 移 液 槍 。 如 果 沒 有 新 購 買 的 移 液 槍 ， 至 少 應 該 使 用 以 前 沒 有 進 行 過 細 胞 培 養 的 移 液 槍 。 因 為 進 行 過 細 胞 培 養 的 移 液 槍 極 有 可 能 被 含 支 原 體 的 培 養 液 污 染 （ 如 細 胞 培 養 時 ， 不 小 心 將 含 支 原 體 污 染 的 培 養 液 吸 入 移 液 槍 的 槍 體 內 ） 。 移 液 槍 中 吸 附 的 支 原 體 有 可 能 造 成 不 必 要 的 假 陽 性 。 （ 4 ） 樣 品 前 處 理 的 各 類 吸 頭 、 離 心 管 ， 以 及 吸 取 陽 性 對 照 D N A 、 待 測 樣 品 D N A 的 吸 頭 ， 務 必 小 心 處 理 ， 請 將 其 裝 入 含 有 半 瓶 水 的 帶 蓋 的 、 可 密 封 的 瓶 子 內 ， 全 部 樣 品 吸 取 完 后 ， 蓋 上 瓶 蓋 ， 以 防 止 陽 性 D N A 的 揮 發 ， 造 成 環 境 的 污 染 ， 進 而 造 成 假 陽 性 。 （ 5 ） 整 個 操 作 過 程 ， 最 好 不 要 說 話 ， 因 為 人 的 口 腔 和 唾 液 都 是 帶 支 原 體 的 。 （ 6 ） 反 應 后 ， 請 勿 打 開 反 應 管 的 蓋 子 ， 否 則 有 可 能 造 成 檢 測 環 境 的 污 染 。 結 果 判 斷 完 后 ， 將 其 用 自 封 袋 密 閉 ， 扔 到 另 外 一 個 房 間 的 垃 圾 桶 內 。 4 . 本 試 劑 盒 的 檢 測 準 確 率 ： （ 1 ） 由 于 本 試 劑 盒 能 識 別 的 支 原 體 大 概 只 占 了 污 染 細 胞 的 支 原 體 的 9 9 % 左 右 ， 還 有 1 % 左 右 的 污 染 細 胞 的 支 原 體 有 可 能 不 認 識 ， 這 可 能 會 導 致 1 % 左 右 的 假 陰 性 （ 漏 檢 ） 。 （ 2 ） 由 于 人 體 的 口 腔 、 皮 膚 和 尿 道 都 是 含 有 支 原 體 的 ， 而 且 常 用 的 腫 瘤 細 胞 系 支 原 體 污 染 率 非 常 高 ， 一 般 在 1 5 9 0 % 之 間 ， 導 致 實 驗 室 環 境 甚 至 移 液 槍 也 經 常 含 有 支 原 體 ， 這 可 能 導 致 出 現 極 個 別 的 假 陽 性 （ 多 檢 ， 正 常 這 種 概 率 應 該 低 于 1 % ） 。 總 體 來 說 ， 單 獨 使 用 本 試 劑 盒 有 可 能 出 現 1 2 % 左 右 的 錯 誤 率 （ 注 意 ： 細 胞 培 養 中 支 原 體 出 現 的 概 率 是 來 自 文 獻 數 據 ， 是 大 量 體 外 細 胞 培 養 支 原 體 污 染 調 查 的 結 果 。 如 果 你 們 實 驗 室 細 胞 污 染 的 恰 巧 是 出 現 概 率 比 較 低 而 本 試 劑 盒 又 不 認 識 的 支 原 體 ， 漏 檢 的 概 率 會 大 幅 度 上 升 。 因 此 ： 對 所 有 重 要 的 樣 品 （ 比 如 ， 可 能 用 于 人 體 的 細 胞 ） ， 不 能 只 依 靠 本 試 劑 盒 就 下 最 終 檢 測 結 論 ， 必 須 至 少 同 時 使 用 另 外 一 種 支 原 體 識 別 率 為 1 0 0 % 的 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 【 比 如 本 公 司 《 P C R 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 或 《 探 針 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 】 進 行 檢 測 ， 互 相 驗 證 ！ ） 。 為 了 提 高 檢 測 的 準 確 率 ， 建 議 客 戶 采 取 以 下 兩 種 措 施 ： 第 一 ， 對 所 有 本 試 劑 盒 檢 測 出 的 陽 性 樣 品 ， 利 用 本 試 劑 盒 或 者 其 他 不 同 原 理 的 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 進 行 復 檢 （ 復 檢 可 以 基 本 排 除 因 環 境 污 染 導 致 的 假 陽 性 ） ， 或 者 檢 測 時 所 有 樣 品 直 接 使 用 兩 個 反 應 管 同 時 檢 測 檢 測 ， 只 有 同 一 個 樣 品 兩 個 反 應 管 的 檢 測 結 果 都 為 陽 性 時 ， 才 能 判 斷 為 真 正 的 陽 性 樣 品 。 第 二 ， 對 所 有 重 要 的 樣 品 （ 比 如 ， 可 能 用 于 人 體 的 細 胞 ） ， 必 須 至 少 同 時 使 用 兩 種 （ 甚 至 三 種 ） 不 同 原 理 的 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 （ 其 中 一 種 方 法 推 薦 使 用 支 原 體 識 別 率 為 1 0 0 % 的 《 P C R 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 或 《 探 針 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 ） 進 行 檢 測 ， 互 相 驗 證 。 5 . 如 發 現 細 胞 被 支 原 體 污 染 ， 本 公 司 提 供 細 胞 專 用 支 原 體 清 除 和 預 防 試 劑 ， 以 及 水 浴 專 用 殺 菌 劑 和 環 境 專 用 殺 菌 劑 。 6 . 支 原 體 檢 測 樣 品 可 以 分 成 兩 類 ： 第 一 類 ， 用 含 血 清 的 培 養 液 培 養 的 哺 乳 動 物 細 胞 上 清 液 ， 由 于 該 條 件 非 常 適 合 支 原 體 生 長 ， 培 養 數 天 后 ， 支 原 體 密 度 一 般 較 高 ， 可 達 1 0 7 9 / m L ， 可 以 直 接 檢 測 。 第 二 類 ， 低 溫 保 存 的 血 漿 、 血 清 、 臍 帶 血 、 胰 酶 、 抗 生 素 、 未 使 用 的 培 養 液 等 樣 品 ， 由 于 這 些 樣 品 即 使 有 支 原 體 污 染 ， 支 原 體 含 量 一 般 很 少 ， 直 接 使 用 快 速 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 進 行 檢 測 ， 往 往 檢 測 不 出 來 。 這 些 樣 品 建 議 ： （ 1 ） 對 樣 品 的 支 原 體 進 行 離 心 濃 縮 或 者 使 用 本 公 司 《 支 原 體 基 因 組 D N A 提 取 試 劑 盒 》 將 支 原 體 D N A 濃 縮 提 取 ， 該 兩 種 方 法 大 約 可 以 將 檢 測 靈 敏 度 繼 續 提 高 1 0 1 0 0 倍 。 該 方 法 速 度 快 ， 當 天 出 結 果 ， 但 是 可 靠 性 不 如 后 面 的 培 養 法 。 （ 2 ） 使 用 支 原 體 液 體 培 養 基 （ 必 須 同 時 接 種 不 含 精 氨 酸 和 含 精 氨 酸 的 兩 種 支 原 體 液 體 培 養 基 ） 培 養 3 7 天 后 ， 再 進 行 檢 測 。 具 體 方 法 請 參 考 本 公 司 《 發 光 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 說 明 書 中 最 后 的 注 意 事 項 部 分 。 該 方 法 速 度 較 慢 ， 需 要 3 7 天 ， 但 是 可 靠 性 高 。 7 . 如 何 提 高 本 試 劑 盒 檢 測 靈 敏 度 ： 如 果 預 期 待 測 樣 品 支 原 體 含 量 較 少 （ 比 如 ， 低 溫 保 存 的 血 清 、 臍 帶 血 、 胰 酶 、 抗 生 素 、 未 使 用 的 培 養 液 、 生 物 制 品 、 極 個 別 細 胞 培 養 上 清 等 ） ， 可 以 采 取 以 下 幾 種 措 施 ： （ 1 ） 通 過 使 用 本 公 司 《 支 原 體 基 因 組 D N A 提 取 試 劑 盒 》 ， 將 支 原 體 D N A 濃 縮 提 取 后 再 進 行 檢 測 （ 提 取 過 程 還 可 以 把 所 有 可 能 的 P C R 抑 制 劑 全 部 去 除 ） ， 大 約 可 以 將 檢 測 靈 敏 度 提 高 1 0 1 0 0 倍 。 （ 2 ） 對 支 原 體 進 行 離 心 濃 縮 ： 取 1 m L 細 胞 上 清 ， 先 1 3 0 0 0 r p m （ 約 1 6 0 0 0 g ） 離 心 5 m i n u t e s ， 吸 走 全 部 上 清 ， 用 5 0 μ L 5 m M T r i s H C l , p H 8 . 0 8 . 8 重 懸 沉 淀 ， 9 5 ℃ 加 熱 處 理 5 m i n u t e s ， 簡 單 離 心 后 （ 1 0 0 0 g ， 5 s e c o n d s ） ， 取 上 清 進 行 檢 測 。 該 離 心 濃 縮 過 程 大 約 可 以 將 檢 測 靈 敏 度 提 高 2 0 倍 。 七 、 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 第 三 方 學 術 機 構 使 用 后 發 表 的 文 章 八 、 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 靈 敏 度 測 試 ? ? ? ? 我 們 選 取 了 比 較 有 代 表 性 的 4 種 支 原 體 （ 分 別 是 ： M . h y o r h i n i s ， M . f e r m e n t a n s A . l a i d l a w i i 和 M . p i r u m ） ， 使 用 含 相 應 支 原 體 基 因 片 段 的 質 粒 載 體 ， 經 D N A 定 量 后 ， 計 算 出 相 應 的 分 子 數 。 ? ? ? ? 質 粒 經 4 倍 系 列 稀 釋 【 從 4 ^ ( 0 ) 到 4 ^ ( 8 ) 】 ， 進 行 相 應 的 恒 溫 擴 增 （ 每 個 反 應 管 的 D N A 加 入 量 為 2 μ L ， 每 個 稀 釋 度 做 2 個 重 復 ） ， 并 對 恒 溫 擴 增 產 物 進 行 拍 照 。 ? ? ? ? 恒 溫 擴 增 反 應 的 結 果 下 圖 2 所 示 ： ? ? 圖 2 . 四 種 支 原 體 質 粒 和 一 種 支 原 體 基 因 組 D N A 經 4 倍 系 列 稀 釋 的 恒 溫 擴 增 反 應 結 果 。 每 個 稀 釋 度 做 2 個 重 復 ， 每 個 反 應 管 的 D N A 加 入 量 為 2 μ L 。 從 結 果 可 知 ： 《 一 步 恒 溫 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 的 檢 測 下 限 范 圍 較 寬 ， 對 于 不 同 的 支 原 體 檢 測 下 限 有 較 大 區 別 ， 從 最 低 的 大 約 2 0 c o p i e s 【 即 大 約 1 0 c o p i e s / μ L 】 （ 圖 1 A 和 1 B ） 到 大 約 1 2 0 4 0 0 c o p i e s 【 即 大 約 6 0 2 0 0 c o p i e s / μ L 】 （ 圖 1 C 1 D ） 。 可 能 的 原 因 是 ： （ 1 ） 恒 溫 擴 增 需 要 多 條 引 物 同 時 起 作 用 ， 而 每 種 支 原 體 的 核 酸 序 列 會 有 所 不 同 ， 導 致 不 同 支 原 體 的 擴 增 效 率 有 一 定 區 別 ； （ 2 ） 本 試 劑 盒 使 用 了 多 套 不 同 的 引 物 ， 每 套 引 物 的 擴 增 效 率 也 會 有 所 區 別 。 我 們 正 在 評 估 是 否 需 要 對 其 中 擴 增 效 率 較 低 的 引 物 組 進 行 優 化 升 級 。 如 果 有 優 化 升 級 ， 后 續 產 品 說 明 書 和 方 法 學 報 告 中 會 有 明 確 說 明 。 ? ? 注 ： 《 一 步 恒 溫 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 檢 測 靈 敏 度 詳 細 數 據 ， 請 參 考 其 方 法 學 報 告 。 九 、 祝 賀 上 海 易 色 醫 療 的 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 2 0 2 4 年 先 后 登 上 中 科 院 S C I 一 區 雜 志 ， 影 響 因 子 分 別 超 6 . 0 和 8 . 0 ！ 上 海 易 色 醫 療 科 技 有 限 公 司 ? ? ? 聯 系 方 式 （ 1 ） 微 信 : 2 7 4 3 7 5 2 1 2 9 （ 7 X 2 4 小 時 在 線 ） ； （ 2 ） 1 7 8 1 1 8 6 6 3 0 8 （ 8 : 0 0 1 8 : 0 0 ） ; （ 3 ） 郵 箱 ： y i s e m e d @ 1 6 3 . c o m 產 品 購 買 ， 請 通 過 微 信 （ 首 選 ） 、 電 話 或 者 郵 箱 等 方 式 提 供 以 下 信 息 ： （ 1 ） 買 方 發 票 抬 頭 、 單 位 稅 號 、 快 遞 地 址 、 聯 系 人 、 電 話 、 電 子 郵 箱 和 負 責 人 姓 名 ； （ 2 ） 購 買 產 品 的 名 稱 、 貨 號 和 數 量 ； （ 3 ） 默 認 隨 貨 只 提 供 發 票 ， 如 果 需 要 我 們 提 供 別 的 材 料 【 如 發 貨 單 、 紙 質 合 同 等 】 ， 請 注 明 。 （ 4 ） 室 溫 和 冰 袋 運 輸 產 品 ， 每 單 收 取 2 5 元 運 費 ； 干 冰 運 輸 產 品 ， 每 單 收 取 1 5 0 元 運 費 。 （ 5 ） 用 易 色 產 品 ， 贏 獎 金 活 動 【 詳 情 請 見 本 網 站 下 載 中 心 頁 面 】 ！ 滬 I C P 備 1 4 0 3 4 3 2 2 號 1 友 情 鏈 接 百 度 丁 香 園 ? 丁 香 通 ? 小 木 蟲 生 物 在 線 首 頁 ? ? ? 公 司 簡 介 ? ? 上 市 產 品 ? ? ? 產 品 價 格 ? ? ? 下 載 中 心 （ P D F 版 說 明 書 ） ? ? ? 聯 系 我 們 ? 【 以 下 為 產 品 快 速 導 航 】 1 、 支 原 體 相 關 產 品 ： 四 款 《 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 選 購 指 南 、 《 一 步 法 恒 溫 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 、 《 P C R 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 《 發 光 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 、 《 探 針 法 支 原 體 檢 測 試 劑 盒 》 、 《 發 光 法 陽 性 對 照 》 、 《 支 原 體 清 除 和 預 防 》 、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 《 水 浴 專 用 殺 菌 劑 》 和 《 環 境 專 用 殺 菌 劑 》 、 《 支 原 體 液 體 培 養 基 ， 不 含 精 氨 酸 和 含 精 氨 酸 兩 種 》 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 《 支 原 體 基 因 組 D N A 提 取 試 劑 盒 》 （ 離 心 柱 法 ） 、 《 豬 鼻 支 原 體 活 菌 種 》 、 《 口 腔 支 原 體 活 菌 種 》 2 、 蛋 白 質 相 關 產 品 ： 《 雙 色 預 染 M a r k e r 和 自 發 光 M a r k e r 套 裝 》 、 《 雙 色 預 染 M a r k e r 》 、 《 W e s t e r n B l o t 專 用 自 發 光 M a r k e r 》 、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 《 超 敏 E C L 發 光 液 》 、 《 B C A 蛋 白 定 量 試 劑 盒 》 3 、 細 胞 相 關 產 品 ： 《 C C K 8 試 劑 盒 》 、 《 原 裝 進 口 胎 牛 血 清 》 、 《 轉 染 試 劑 》 4 、 D N A 相 關 產 品 ： 《 超 級 D N A 上 樣 緩 沖 液 ： 無 需 E B 染 色 ， G e l R e d 升 級 產 品 》 ? 滬 公 網 安 備 3 1 0 1 0 7 0 2 0 0 3 0 2 4 號

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